1材料与方法

1．1材料

水杉球果于2008年10月采自湖北利川水杉坝，自然风干裂开后将种子挑出。

1．2方法

1．2．1不同光照处理对种子萌发的影响以脱脂纱布作为发芽床，每个培养皿中铺两层脱脂纱布，包好灭菌待用。分别置于全光照、全黑暗、光照黑暗交替条件下（光照黑暗交替处理的光照时间为12h／d，以日光灯作为光源）于（25±2）℃培养。每处理3个重复，每个重复播种100粒种子。统计并计算其发芽率，发芽率＝15d内发芽的种子数／供试种子总数×100％。

1．2．2室温和4℃干藏条件对水杉种子萌发的影响经室温和4℃干藏条件处理的水杉种子，每15d取样一次，用于萌发试验。将取样的水杉种子于25℃水中浸泡12h，除去漂浮的种子。以铺湿纱布的培养皿为发芽床，每个培养皿中播种100粒水杉种子。每个处理3次重复。在（25±2）℃的培养箱中进行全黑暗处理，观察记录。对室温和4℃干藏条件下材料每隔15d进行取样，每次取样品10份，每份0．3g。经液氮速冻后，置于－70℃超低温冰箱中保存备用。

1．2．3酶液的制备用取自不同处理条件下的样品0．3g，加入0．1g聚乙烯吡咯烷酮，2．0mLpH值7．8的磷酸缓冲液，于冰上研磨成匀浆，分装于2mL的离心管中，冰浴上静置1～2h。4℃、12000r／min离心20min，重复3次，取上清液，得到酶液，－20℃冰箱保存备用。

1．2．4POD活性的测定采用联苯胺比色法测定POD活性。取稀释10倍的酶液0．5mL，加入1mL联苯胺醋酸－醋酸钠缓冲溶液，30℃水浴保温5min。测定时加0．5mL0．1mol／L的H2O2，立即摇匀，并转入比色皿中，于波长580nm处测定吸光度，从加入H2O2起计时，每15s读数一次。按下式计算样品中POD活性。E＝△OD（15－45）×2×稀释倍数／1000。

1．2．5SOD活性的测定采用氮蓝四唑（NBT）法［10］测定SOD的活性。取4支5mL的指形管，其中3支为测定管，1支为对照管，按表1加入各溶液。

混匀后将对照管置暗处，其他各管于4000lx日光灯下反应2min，之后用黑布终止反应。反应结束后以不照光的对照管做空白，立即将测定管置于560nm处测定其他各管的吸光度。已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝（ODCK－ODE）×V×2／ODCK×W×VT。

1．2．6可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法。取11支2mL的EP管从0～10分别编号，按表2加入溶液和PBS。按顺序向EP管中加入0．1mL蒽酮乙酸乙酯试剂和1mL浓硫酸，充分振荡，在沸水中保温1min。取出自然冷却，以空白管做对照。在630nm下测吸光度。以吸光度为纵坐标，糖含量为横坐标，绘制标准曲线。取0．4mL稀释200倍的酶液，加0．1mL蒽酮乙酸乙酯和1mL浓硫酸，充分振荡后，在沸水中保温1min，取出自然冷却后测样品的吸光度。